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BLICKWINKEL

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Prof. Dr. Rüdiger Rudolf über die Entwicklung von „Organoiden“ auf Basis komplexer 3D-Zellkulturen für das Screening neuer bioaktiver Wirkstoffe für Hautpflegeprodukte und die Biomedizin.

Organoide – Wirkstoffscreening treibt Entwicklung neuer Technologien voran

Bislang beruhte das Screening von Wirkstoffen und Arzneimitteln meist entweder auf zweidimensionalen (2D) Zellkulturen oder auf Tierversuchen. Beiden Ansätzen wohnen jedoch bedeutende Nachteile inne. Zum einen sind 2D-Zellkulturen zwar preisgünstig in der Herstellung und Durchführung der Versuche, sie sind für hohe Durchsatzraten geeignet und sie erlauben die Verwendung von Zellen menschlichen Ursprungs, flache Petrischalen stellen jedoch aufgrund ihrer Steifigkeit und der Beschränkung der Kontaktbildung auf eine Seite der Zelloberfläche eine höchst unnatürliche Umgebung für das Screening dar. Darüber hinaus gestaltet sich die Durchdringung der Zellen mit Wirkstoffen ebenso wie die Verteilung von Abfallprodukten, Sauerstoff und Nährstoffen in solchen 2D-Kulturen völlig anders als in den dreidimensionalen Anordnungen echten menschlichen Gewebes. Tiermodelle hingegen weisen oft eine andere Physiologie im Vergleich zum Menschen auf. Überdies gestalten sich Tierversuche schwierig, sind teuer in der Durchführung und werden in Bezug auf ethische Aspekte vermehrt problematisch gesehen. Daher und aufgrund einer Reihe jüngst erzielter technologischer Fortschritte vollzieht sich derzeit ein Paradigmenwechsel in weiten Bereichen der Grundlagen- und der angewandten Forschung. Tatsächlich werden zunehmend komplexere 3D-Zellkulturen entwickelt, die häufig auf Zelllinien basieren, weil diese einfach und reproduzierbar kultiviert werden können. Zunehmend aber werden diese Modelle aus menschlichem Primärmaterial gebildet. Dazu gehören Kulturen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen oder aus Krebszellen von Biopsien gewonnen werden. Interessanterweise sind viele dieser komplexen 3D-Kulturen in der Lage, nicht nur die Zusammensetzung von Zelltypen in Organen, sondern auch wesentliche Aspekte ihrer Funktionen nachzuahmen, weswegen sie oft als „Organoide“ bezeichnet werden. Organoid-Technologien gelten derzeit als Goldstandard für Arzneimitteltests, insbesondere zur Modellierung komplexer Organfunktionen oder für Entwicklungen hin zu einer personalisierten Medizin. Unter anderem deshalb wurden sie von der Fachzeitschrift Nature Methods zur Technologie des Jahres 2017 gekürt. Ohne Frage gehören 3D-Zellkulturen und Organoid-Technologien im Moment zu den explorativsten und dynamischsten Bereichen der Biomedizin. Aufgrund ihrer Dreidimensionalität und Neuartigkeit ist der Werkzeugkasten für ihre Herstellung, Untersuchung und Auswertung bislang noch alles andere als vollständig. Und eben diese Diskrepanz zwischen biomedizinischer Relevanz einerseits und dem teilweisen Fehlen praktikabler Methoden auf beinahe allen Ebenen der Arbeit mit 3D-Zellkulturen andererseits machen das Forschungsfeld der Organoide zu einem wesentlichen Motor für die Entwicklung neuer Technologien.

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Abb. 2: Mikroskopische Struktur einer Geschmacksknospe. Konfokalmikroskopische Aufnahme eines Geschmacksknospenschnitts. Zellkerne in Blau, Geschmacks- und apikale Epithelzellen in Grün, Stamm- und untere Epithelzellen in Rot. Die Papille hat eine Höhe von etwa 100 µm.

Angewandte dreidimensionale Geschmacks- und Hautforschung mit vereinten Kräften

An genau dieser Schnittstelle zwischen der biomedizinischen/bioökonomischen Suche nach Verbindungen, der Notwendigkeit zur Entwicklung neuartiger und relevanter Testmodelle für 3D-Zellkultursysteme sowie der Entwicklung einschlägiger Technologien haben sich BRAIN und die Hochschule Mannheim im öffentlich-privaten und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) geförderten Partnerschaftsprojekt M2Aind (Multimodale Analytik und Intelligente Sensorik für die Gesundheitsindustrie) zusammengeschlossen. Das Forschungsprojekt, das in seiner ersten Phase von Januar 2017 bis Ende 2020 angesetzt ist und gegebenenfalls um vier weitere Jahre verlängert werden kann, verfügt dank der Förderung durch das BMBF sowie aufgrund von Industriemitteln über ein Gesamtbudget von mehr als 6,5 Millionen Euro. Ziel des Projekts ist die Entwicklung industriegetriebener, hochintegrierter Anwendungen, die vor allem den Aufbau komplexer 3D-Zellkulturmodelle und deren anschließende Lebendzell- und Ex-vivo-Analytik mithilfe der Massenspektrometrie, Infrarot- sowie Fluoreszenzmikroskopie beinhalten. Andere Bereiche des Projekts, die letztendlich ebenfalls in die hochintegrierten Anwendungen Eingang finden sollen, beschäftigen sich mit weiteren Sensorsystemen, darunter der Ramanspektroskopie, sowie mit der Entwicklung effizienterer Herstellungsverfahren für Wirkstoffe. In diesem Gesamtrahmen fokussiert sich M2Aind auch auf zwei Produktentwicklungsbereiche der BRAIN AG, nämlich die der Nutrazeutika und Hautkosmetik. In beiden Feldern hat erheblicher interner Forschungseinsatz bei BRAIN zu großen Fortschritten geführt, so zum Beispiel bei Biosensor-exprimierenden oder anderen gentechnisch veränderten menschlichen Zellen sowie bei geeigneten Auslesungen in 2D-Kulturen und produktorientierten Hypothesen über bekannte oder neuartige mechanistische Prozesse auf der Ebene der Zellbiologie.

Ein schmackhaftes Projekt: Arbeiten in 3D

Der Geschmack bzw. Geschmackssinn beruht hauptsächlich auf den sogenannten Geschmacksknospen, die sich an bestimmten Stellen auf der Zunge befinden. Anatomisch gesehen bestehen die Geschmacksknospen aus randständigen Stützzellen, basalen Stammzellen sowie Geschmackssinneszellen an der Spitze der Knospe. Je nach molekularer Ausprägung wandeln die Sinneszellen bestimmte Geschmacksmodalitäten wie salzig, sauer, süß, umami und bitter (vielleicht gibt es auch noch weitere) in intrazelluläre Signale um, die schließlich in einem noch immer nur unvollständig erforschten Prozess an das zentrale Nervensystem weitergegeben und von diesem interpretiert und in unsere Empfindung der entsprechenden Geschmacksmodalität umgewandelt werden. Bei der Entwicklung von Nutrazeutika ist es bislang üblich, professionelle Geschmackstester einzubinden, die neuartige Verbindungen in Bezug auf ihre Geschmackseigenschaften charakterisieren. Um diese Vorgehensweise durch ein standardisiertes und molekular gut kontrolliertes In-vitro-Testsystem zu ersetzen, wurden bei BRAIN Zelllinien aus menschlichen Geschmacksknospen etabliert und in 2D-Zellkulturen detailliert charakterisiert. Während die Zellantworten in Bezug auf bestimmte Geschmacksmodalitäten eine hohe Effizienz aufwiesen, traf dies in anderen Bereichen nicht zu und es entstand der Wunsch, ein dreidimensionales, physiologisch korrekteres und repräsentativeres Modell zu erstellen. Hier kam die Zusammenarbeit mit der Hochschule Mannheim ins Spiel. Durch die Verbindung der enormen geschmacksbezogenen Expertise bei BRAIN und der im Unternehmen vorhandenen einzigartigen Zellsysteme mit den Möglichkeiten der Hochschule in Sachen 3D-Zellkulturen und Analytik war es möglich, die Geschmackszellkultur unter Verwendung unterschiedlicher Ansätze, so zum Beispiel mit klassischen Sphäroidformaten oder chip-basierten Systemen eines anderen M2Aind-Partners, 300MICRONS, von 2D auf 3D umzustellen. Zur Charakterisierung dieser Methoden wurden analytische Verfahren, darunter auch 3D-Ex-vivo- und 3D-Lebendzell-Analytik, entwickelt. Deren Anwendung zeigte, dass im Vergleich zur 2D-Kultur manche entscheidende Merkmale, wie zum Beispiel die Zellantworten auf bestimmte Geschmacksstoffe, erhalten blieben. Andere Eigenschaften aber, wie beispielsweise Morphologie und Ausrichtung der Zellen, unterlagen tiefgreifenden Veränderungen. Für diese Arbeiten mussten unter anderem neue Methoden zur räumlichen Fixierung der 3D-Kulturen während der Perfusion und für den Umgang mit diesen dreidimensionalen Objekten bei den engen räumlichen Verhältnissen am Mikroskop gefunden werden. Derzeit werden spezielle Co-Kultursysteme mit anderen geschmacksrelevanten Zelltypen untersucht, um die Modelle weiter an das physiologische System anzunähern. Langfristiges Ziel ist die Modellierung eines Geschmacksknospen-Organoids, das bestimmte Geschmacksmodalitäten standardisiert überwachen kann und auf diese Weise In-Vitro-Tests neuer Geschmacksstoffe ermöglicht.

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Abb. 3: Eigenschaften von Hautzellsphäroiden. Konfokalmikroskopische Aufnahmen von Schnitten durch Keratinozytensphäroide zeigen die Stratifizierung von Differenzierungsmardern (linkes Bild, differenzierte Zellen in Grün) und das gemischte Auftreten von Apoptose (rechtes Bild, apoptotische Zellen in Grün). Rote Signale zeigen entweder weniger differenzierte Zellen (linkes Bild) oder Zellkerne (rechtes Bild). Durchmesser der Sphäroide jeweils etwa 300 µm.

Anschwellen oder nicht anschwellen, das ist hier die Frage

Ein weiterer Schwerpunkt der Zusammenarbeit zwischen BRAIN und der Hochschule Mannheim besteht in der Etablierung von 3D-Modellen zur Untersuchung der molekularen Mechanismen, die dem Wachstum, dem Anschwellen und der Faltenbildung der Haut zugrunde liegen. Dieses Wissen soll dann für die Suche nach neuen Verbindungen von kosmetischem oder therapeutischem Wert genutzt werden. Ausgelöst durch das Verbot von Tierversuchen für Kosmetika und die grundlegenden Unterschiede in der Hautstruktur zwischen dem Menschen und vielen Säugetieren hat die dermatologische Forschung Jahrzehnte der Entwicklung von 3D-Modellen durchlaufen und dabei die unterschiedlichsten, stark geschichteten und oftmals mit dem Air-Lift-Verfahren erstellten, also auf einer Schicht aus Luft kultivierten, Hautäquivalente hervorgebracht. Die Untersuchung von Prozessen wie Hautschwellung und die Zell-Zell-basierte und vom Differenzierungsstatus abhängige Reaktion einzelner Zellen auf osmotische Veränderungen erweist sich bei diesen Modellen jedoch als überaus schwierig, was im Wesentlichen mit deren systemimmanentem Aufbau zusammenhängt. Um diese Schwierigkeiten zu umgehen, sind an der Hochschule Mannheim 3D-Sphäroide unter Verwendung mehrerer von BRAIN erstellter Keratinozyten-Zelllinien entwickelt worden. Die Analyse dieser 3D-Kulturen bestätigte eine hoch reproduzierbare Stratifizierung in Basalzellen und differenzierteren Schichten, wie diese auch in der menschlichen Haut zu finden ist. Erfreulicherweise waren die erhofften Zellantworten, wie zum Beispiel das Anschwellen unter hypoosmotischen Bedingungen und der darauf folgende regulierte Volumenrückgang beim Live-Cell-Imaging von Sphäroiden aus Biosensor-tragenden Keratinocyten, zu beobachten. Die Zusammenführung dieser Sensorwerte mit geeigneten genetischen Modellen macht es nun möglich, diese Eigenschaften bestimmten Molekularmechanismen zuzuordnen. Weiterhin ist es vorstellbar, solche Modelle zur Identifizierung neuer Wirkstoffe und Verbindungen zu nutzen.

Datenmanagement – verloren im Raum

Die schöne neue Welt der 3D-Zellkultur bringt deutliche Fortschritte für unsere Modelle in Bezug auf ihre physiologische Relevanz und damit hoffentlich auch in Hinsicht auf ihre Vorhersagekraft mit sich. Die Hinzunahme einer dritten Dimension in der Zellbiologie potenziert jedoch unweigerlich die Datenmengen, die dabei erzeugt werden und somit auch gespeichert und analysiert werden müssen. Dies war und ist auch gegenwärtig der Auslöser für enorme gemeinsame Anstrengungen von Wissenschaft und Industrie, um diese anstehenden Probleme zu lösen. Tatsächlich hat sich das Geschäft mit 3D-Zellkulturen und Organoiden schnell von einer bescheidenen monatlichen Datenmenge im Megabytebereich zu einem nach oben hin praktisch offenen Projekt entwickelt, das derzeit üblicherweise Daten in der Größenordnung einiger Terabyte pro Monat generiert. Das lässt sich in erster Linie auf neuartige Highend-Analytikansätze wie die Lichtscheibenmikroskopie zurückführen, die es ermöglicht, das Verhalten lebender Zellen dreidimensional mit hoher Geschwindigkeit und bei Einzelzellauflösung zu beobachten. Unverkennbar wird unter solchen Bedingungen eine sichere und effiziente Datenspeicherung immer bedeutsamer; eine effiziente Datenanalyse komplexer zellulärer Informationen ist jedoch ebenso wichtig und erfordert umfangreiche Rechenarbeit. Neben der reinen Rechenleistung ist die zuverlässige automatisierte Identifizierung relevanter Merkmale eine große Herausforderung.

In der jüngsten Vergangenheit konnten wir einige dieser Problemstellungen durch die Übernahme und Anpassung von Open-Source-Anwendungen lösen, aber es wird noch erheblicher Einsatz erforderlich sein, um hochkomplexe Merkmale wie zum Beispiel schnelle Signaltransduktions-Antworten lebender Zellen nach einer Stimulation in multizellulären 3D-Kulturen zu quantifizieren. Eine atemberaubende Reise in die Galaxien der 3D-Zellkultur und Organoide steht gerade erst an ihrem Anfang. Auf dieser Reise werden wir uns sicherlich vielen Herausforderungen stellen und diese bewältigen müssen, gleichgültig ob wir darauf vorbereitet waren oder nicht. Aber sie wird uns mit Sicherheit auch in noch unerforschte magische Welten führen, in denen wir auf neue Technologien, Biologien und Verbindungen stoßen werden. Bitte vergewissern Sie sich, dass Ihre Sitzgurte fest geschlossen sind.

M2Aind - Multimodal Analysis and Intelligent Sensorics in the Health Industries

https://www.m2aind.hs-mannheim.de/
Rudolf Ruediger

Prof. Dr. Rüdiger Rudolf

Prof. Dr. Rüdiger Rudolf vertritt das Fachgebiet Biosensorik an der Hochschule Mannheim und leitet das Teilprojekt Molekulare Humane Organoid- und Gewebeanalytik in der FH-Impulspartnerschaft M2Aind (www.m2aind.hs-mannheim.de). In dieser Funktion untersucht er gemeinsam mit Prof. Dr. Mathias Hafner, Dr. Tiziana Cesetti, M. Sc. Elena von Molitor und Dr. Mario Vitacolonna die Nutzung von 3D-Zellkulturtechnologien, 3D-Lebendzellanalytik, Gewebeklärung, 3D-Mikroskopie, Biosensoren und automatisierter Quantifizierung für Substanztestung in der Bioökonomie und Biomedizin, mit Schwerpunkten in den Bereichen Geschmack und Haut.

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